細(xì)胞培養(yǎng)是實驗室的常規(guī)操作和科研基礎(chǔ)。其中，保證細(xì)胞不受支原體的污染是決定實驗成敗的重要環(huán)節(jié)。然而，支原體污染細(xì)胞的發(fā)生率又非常高,有報道高達(dá)63%。

那么，這些支原體污染是從哪里來的呢？

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特別是支原體的污染能通過細(xì)胞操作產(chǎn)生的氣溶膠或液滴傳播。一瓶被支原體污染的細(xì)胞足以威脅到其他培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，定期對細(xì)胞培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行支原體的監(jiān)測是非常重要的。

在支原體的各種檢測方法中，常規(guī)PCR法以其

①靈敏度高，特異性好；

②時間短，2-3小時出結(jié)果；

③操作簡單；

④無須昂貴儀器等特點廣受青睞。

但不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異較大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

這里小編向您推薦的是德國Minerva Biolabs公司的常規(guī)PCR檢測試劑盒（一步法）（英文名：Venor®Gem OneStep），它經(jīng)過許多用戶使用過，*。

產(chǎn)品介紹

其中貨號11-8025、11-8050為常備現(xiàn)貨。

優(yōu)勢

①高特異性。如存在支原體污染，則只在270bp左右有一條陽性條帶，無雜帶現(xiàn)象，方便辨識。對其他物種如細(xì)菌、真核生物DNA無交叉反應(yīng)。

②可檢測的支原體種類豐富。支原體屬柔膜體綱、支原體目，下分為支原體科、無膽甾原體科和脲原體科，一共有100多種。Venor®Gem一步法試劑盒可檢測85種支原體科成員(含所有污染細(xì)胞的常見支原體)、7種無膽甾原體和1種脲原體，十分全面。

③所需樣本量少，僅需2ul。

④靈敏度高，靈敏度高，即使每個反應(yīng)只有20個基因組拷貝，也可以檢測出來。

⑤結(jié)果可靠。檢測時含陰性對照、陽性對照和內(nèi)控對照，可避免假陰性和假陽性。

⑥試劑穩(wěn)定，操作簡單。試劑盒內(nèi)的PCR mix和陽性對照均為凍干粉，穩(wěn)定性強。只需復(fù)溶后即可立即使用，除樣品外，無須添加其他試劑。PCR mix已包含內(nèi)控對照，無須再單獨添加（因此被稱為一步法）。

適用范圍

適用于支原體的篩查。適合細(xì)胞培養(yǎng)物和生物樣品，僅作研究使用，不適合藥廠的放行檢測。不適合臨床診斷。

操作步驟

第1步：樣本處理

第2步：試劑制備

第3步：PCR體系建立

第4步：啟動PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時，由于內(nèi)控對照與支原體DNA存在競爭，內(nèi)控對照條帶變?nèi)酰ɡ绠?dāng)支原體DNA＞103拷貝時）。

當(dāng)支原體DNA＞104拷貝時，內(nèi)控對照條帶會*消失。

在80-90bp可能存在引物退火形成的二聚體條帶，此條帶不影響檢測結(jié)果。